脊髓损伤(SCI)会产生以损伤相关分子模式(DAMP)和免疫细胞激活为特征的炎症微环境，这会加剧继发性损伤并损害神经功能恢复。此外，受损脊髓中巨噬细胞的发生不平衡极化。促炎性M1表型巨噬细胞的激活水平持续升高，而潜在的修复性M2表型巨噬细胞的激活水平降低，导致炎症持续时间延长和组织重塑失败。另一方面，SCI炎症微环境不利于神经干细胞的存活、迁移和分化，严重阻碍了内源神经干细胞/前体细胞在损伤后的轴突生长及神经分化再生作用，影响损伤区神经网络的重建以及功能的恢复。因此，重建SCI免疫炎症微环境对提升脊髓再生修复的效果十分关键。

图1：一种免疫调节性水凝胶支架促进脊髓损伤后神经再生的示意图

   左：用阳离子聚合物聚(酰胺胺)和抗炎细胞因子IL-10修饰的光交联明胶水凝胶。该支架在体外促进M2巨噬细胞极化和神经元分化。右：移植双功能免疫调节支架到到小鼠脊髓损伤部位，在此清除DAMPs，减少炎症，并增强组织重塑和神经再生。

图2：水凝胶支架的表征

   (A)为GL(明胶)、Scav-GL(明胶+PAAM-G3)、Delv-GL(明胶+IL-10) 和 Scav/Delv-GL(明胶+ PAAM-G3+ IL-10) 支架的扫描电镜图像，图像表明所有支架的孔径相似，孔径为60-180μm。(B)支架的压缩模量。(C)水凝胶支架7、14、21和28天的体外降解率。(D)DAMP溶液中总蛋白质的清除百分率。(E)HMGB1和(F)细胞外DNA的水平在SCAV-GL支架孵育后的水平。(D-F)表明用含有PAAM-G3的支架处理后，无细胞DNA(cfDNA)和HMGB1蛋白(阴离子DAMP)的量以及溶液中总蛋白的量减少。(G)一天后，Delv-GL和Scav/Delv-GL水凝胶分别释放了大约24.4%和23.7%负载的IL-10，随后IL-10逐渐释放，IL-10在SCAV/Delv-GL支架中释放21d的比例约为52.4%。在水凝胶中加入PAMAM-G3对IL-10的缓释行为无明显影响。

图3：Scav/Delv-GL支架对巨噬细胞和小胶质细胞促炎活性的调节

   (A)白介素(IL-1β)， (B) TNF-α和(C) iNOS在经DAMPs刺激和PBS, GL, Scav-GL, Delv-GL或Scav/Delv-GL支架处理后M1极化RAW264.7细胞中的定量表达。(D)iNOS的免疫荧光染色，Scav /Delv-GL组中iNOS阳性染色的细胞数量减少。(E)IL-1β、(F)TNF-α 和(G)iNOS的基因表达水平。(H)在 DAMPs 刺激后用 PBS、GL、Scav-GL、Delv-GL 或 Scav/Delv-GL 支架处理M1极化BV2细胞的iNOS的免疫荧光图像。表明Scav/Delv-GL治疗组的iNOS表达显着低于所有其他组。这些结果表明，免疫调节支架(Scav-GL，Delv-GL和Scav / Delv-GL)显着抑制DAMP诱导的巨噬细胞和小胶质细胞中的促炎反应。

图4：Scav/Delv-GL支架在神经元分化中的作用

   对神经特异性分化标志物微管蛋白(Tuj-1)进行免疫染色的图像(神经元：Tuj-1，绿色;细胞核：DAPI，蓝色。)。在将DAMPs添加到神经源性分化培养基后，观察到的Tuj-1阳性细胞很少，这表明DAMPs对神经发生的抑制作用。空白水凝胶(GL)并没有减轻 DAMPs 对NSCs的影响。Scav / Delv-GL和Scav-GL组中Tuj-1阳性神经细胞的数量显着升高，表明神经源性分化更大。Delv-GL组中暴露于DAMPs的Tuj-1阳性细胞数量也有所增加，但分化程度低于Scav / Delv-GL和Scav-GL治疗组。

图5：在急性期，Scav / Delv-GL支架的植入减少了促炎细胞因子的表达，并减少了病变部位的巨噬细胞和小胶质细胞的数量

   (A)为SCI后第7天对照组，GL组，Scav-GL组，Delv-GL组和Scav / Delv-GL组脊髓组织中炎症细胞因子水平变化的热图分析， Scav / Delv-GL组中促炎细胞因子的浓度显着降低。(B)各组SCI小鼠脊髓组织中IL-1β和TNF-α表达的图像，(C-D)为(B)中各组的定量分析。(E-J)通过免疫染色观察SCI急性期病变区巨噬细胞和小胶质细胞的分布和免疫表型，检测ED1(反应性小胶质细胞/巨噬菌体标志物)，F4/80(巨噬细胞标志物)和Iba-1(小胶质细胞标志物)的表达。图像显示Scav/ Delv-GL组的阳性染色巨噬细胞和小胶质细胞的数量显着低于其他四组。结果表明在脊髓损伤部位植入Scav/Delv-GL和Scav-GL支架可减少急性期促炎细胞因子的分泌。

图6：Scav/Delv-GL支架植入调节炎症细胞亚型

   (A-D)损伤后7天对照组、GL、Scav-GL、Delv-GL和Scav/Delv-GL组中iNOS 和ARG-1的免疫荧光染色图像与定量分析。iNOS(M1型)和ARG-1(M2型)。图像表明，损伤后第7天，Scav/Delv-GL组和Scav-GL组损伤部位和周围组织区域iNOS阳性细胞数量明显低于对照组和GL组。在损伤区域植入水凝胶支架，特别是Delv-GL支架增加了ARG-1阳性细胞的数量，这表明Scav / Delv-GL支架调节了SCI急性期受损脊髓中巨噬细胞和小胶质细胞的M1 / M2极化。

图7：病变部位的长期炎症反应

   (A-C)手术后 8 周，对照组、GL、Scav-GL、Delv-GL 和 Scav/Delv-GL组中的IL-1β和TNF-α表达水平和ED1、F4/80和Iba-1免疫荧光染色。结果表明Scav-GL组、Delv-GL组和Scav/Delv-GL组IL-1β和TNF-α的表达水平低于未处理的对照组和GL组。此外，在植入Scav / Delv-GL支架的小鼠受损组织的中心区域发现的ED1，F4 / 80和Iba-1阳性细胞明显少于其他四组。结果表明，免疫调节功能支架，特别是 Scav/Delv-GL支架，减弱了长期的促炎反应，因此有助于减少 SCI 后慢性期的炎症微环境。这些结果表明，免疫调节功能支架，特别是 Scav/Delv-GL支架，减弱了长期的促炎反应，因此有助于改善SCI后慢性期的炎症微环境。

图8：神经再生和功能恢复

   (A)SCI第7天各组小鼠病变部位的Tuj-1阳性轴突荧光染色。图像表明，在手术后七天，Scav / Delv-GL和Delv-GL组中Tuj-1阳性新生成的神经元数量高于Scav-GL，GL和未治疗的对照组。(B-C)：病变中心的Tuj-1阳性细胞和术后8周对照各组中脊髓组织样本的MAP2表达水平。(D-F)术后8周各组后肢的运动诱发电位(MEPs)响应于大脑的电刺激。观察到用Scav / Delv-GL支架治疗的小鼠(平均潜伏期3.39 ± 0.06毫秒；平均MEP振幅0.14 ± 0.02 mV)治疗的小鼠的运动诱发反应比用Scav-GL处理的小鼠(平均潜伏期4.28±0.84毫秒；平均幅度0.12 ± 0.05 mV)或Delv-GL(平均潜伏期4.17 ± 0.79毫秒；平均幅度：0.11 ± 0.04 mV)更大。(G)为不同组小鼠后肢野外行走得分(BMS)评分。这些结果表明，DAMP 清除和 IL-10 缓释对于 SCI 模型中的长期运动功能恢复都很重要。

【总结】

   在脊髓损伤中，病变部位及其周围的免疫微环境在神经再生和功能恢复中起着重要作用。这篇文章开发了一种清除DAMP并缓慢释放 IL-10的双功能免疫调节支架，该支架可减少促炎细胞，同时增强抗炎细胞反应，加速神经再生，并改善运动的长期恢复体内功能。